近日，由澳大利亚彼得·麦克卡勒姆癌症中心Phillip K. Darcy、Paul A. Beavis和Junyun Lai领衔的团队[1]，以及宾夕法尼亚大学Evan W. Weber和斯坦福大学Crystal L. Mackall领衔的团队[2]，背靠背在顶级期刊《自然》上发表了两篇重磅研究成果，同时将FOXO1蛋白锁定为调节CAR-T细胞持久性的总开关。

简单来说，只要让CAR-T细胞过表达FOXO1蛋白，就会让CAR-T细胞具有类似干细胞特征，并让CAR-T细胞具备持久抗肿瘤活力。

图源：斯坦福大学医学院 

正如前文所言，寻找让CAR-T细胞更持久的方法，是CAR-T细胞治疗领域的焦点问题。

目前主要的研究方向有两个：一个是从接受CAR-T细胞治疗后获得持久缓解的患者入手，研究这些患者体内CAR-T细胞的特征[3,4]，后续在这些研究的基础上改进CAR-T细胞治疗；另一种就是直接从影响T细胞持久性的因子入手，寻找突破口。今天介绍的这两个研究都采用了第二种方法。

Darcy团队在前期的研究中发现，在培养CAR-T细胞的时候，如果加入IL-15的话，可以让CAR-T细胞有更强的持久性。这一次他们发现，IL-15处理的CAR-T细胞会表现出记忆T细胞表型，并在乳腺癌小鼠模型中表现出更强的持久性。于是，他们想知道IL-15对CAR-T细胞究竟产生了什么影响。

在分析IL-15处理的CAR-T细胞多组学数据之后，发现Foxo1基因特征强烈富集。在CAR-T细胞中过表达FOXO1蛋白，可以让CAR-T细胞具备干细胞表型，进而提升CAR-T细胞对多种实体瘤小鼠模型的控制能力。要知道，CAR-T细胞对实体瘤往往是没有效果的。

值得注意的是，与IL-15调节的其他转录因子——TCF1（干细胞特征标志物）的过表达相比，FOXO1蛋白的过表达能在更大程度上保持CAR-T细胞的“干性”和持久性。

Darcy团队研究论文首页截图

与上一个研究类似，Mackall和Weber团队的研究成果也是在之前的研究上展开的。

他们于2021年发表在《科学》上的一篇研究论文[5]表明，通过瞬时抑制CAR信号，让耗竭的CAR-T细胞休息，可促进记忆样表型的形成，并增加记忆转录因子TCF1和FOXO1调节的染色质可及性。因此，他们猜测TCF1和FOXO1这两个转录因子可能就是介导CAR-T细胞持久性的关键。

实际上，已经有研究发现，TCF1的表达水平与患者对CAR-T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或免疫检查点抑制剂疗法的反应广泛相关。而FOXO1直接调控TCF1等典型免疫记忆相关蛋白的表达，并促进小鼠记忆T细胞的形成；甚至药理抑制FOXO1的负调控因子AKT，可以使人CAR-T细胞和TILs产生早期记忆表型。

以上的研究成果意味着，Mackall和Weber的猜想可能是正确的。接下来他们就要验证TCF1和FOXO1，究竟谁是人CAR-T细胞记忆编程和抗肿瘤功能所必需的。

Mackall和Weber团队的第一个实验是，分别过表达TCF1和FOXO1，看看二者如何影响CAR-T细胞。结果他们发现，只有FOXO1过表达才会导致记忆相关的细胞表面标志物和转录因子表达增加。

值得注意的是，在慢性刺激的条件下，FOXO1过表达诱导的是记忆相关基因表达程序，而TCF1过表达则会促进耗竭前体T细胞样程序。如此看来，FOXO1才是他们要寻找的目标。

让CAR-T细胞过表达FOXO1蛋白之后，CAR-T细胞对抗白血病和实体瘤的能力都增强了，而且肿瘤再挑战的时候，过表达FOXO1的CAR-T细胞数量会显著增加。出人意料的是，“干性”标志物TCF1竟然不是必需的，敲除TCF1的编码基因，不影响FOXO1过表达给CAR-T细胞带来的好处。

随后，他们用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除CAR-T细胞的FOXO1的编码基因，结果发现，CAR-T细胞的扩增水平下降、CD8阳性率下降、记忆相关标志物减少，以及耗竭相关标志物增加。

此外，FOXO1编码基因被敲除的CAR-T细胞，或者FOXO1抑制剂处理的CAR-T细胞，在面对肿瘤的时候，均表现出杀伤力减弱和/或细胞因子分泌减少的现象；而且FOXO1编码基因被敲除的CAR-T细胞控制肿瘤的能力显著减弱，肿瘤小鼠模型的存活率大幅降低。

总的来说，这两项研究表明，过表达与免疫记忆相关的转录因子可以重编程CAR-T细胞，使其持久存在，并保持抗肿瘤活性。值得一提的是，这也是科学家首次发现，内源性FOXO1蛋白是免疫记忆相关基因表达和维持工程化人T细胞最佳抗肿瘤功能所必需的。

据了解，Darcy团队正在跟临床专家沟通，预计近两年内在临床上测试FOXO1过表达的CAR-T细胞。希望这两项研究成果能帮助CAR-T细胞开疆拓土，尤其是要拿下实体瘤。

参考文献：

[1].Chan, J.D., Scheffler, C.M., Munoz, I. et al. FOXO1 enhances CAR T cell stemness, metabolic fitness and efficacy. Nature. 2024. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07242-1

[2].Doan, A.E., Mueller, K.P., Chen, A.Y. et al. FOXO1 is a master regulator of memory programming in CAR T cells. Nature. 2024. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07300-8

[3].Melenhorst JJ, Chen GM, Wang M, et al. Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells. Nature. 2022;602(7897):503-509. doi:10.1038/s41586-021-04390-6

[4].Anderson, N.D., Birch, J., Accogli, T. et al. Transcriptional signatures associated with persisting CD19 CAR-T cells in children with leukemia. Nat Med, 2023. https://doi.org/10.1038/s41591-023-02415-3

[5].Weber EW, Parker KR, Sotillo E, et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 2021;372(6537):eaba1786. doi:10.1126/science.aba1786